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法庭科学DNA实验室检验规范(GAT 383-2014)

法庭科学DNA实验室检验规范(GAT 383-2014).本标准规定了法庭科学DNA实验室检验应遵守的基本要求。 本标准适用于所有从事法庭科学检验的DNA实验室。..

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法庭科学DNA实验室检验规范(GAT 383-2014)

发布时间:2024-02-15 14:52:05 热度:56

法庭科学DNA实验室检验规范(GAT 383-2014)

1 范围。本标准规定了法庭科学DNA实验室检验应遵守的基本要求。 本标准适用于所有从事法庭科学检验的DNA实验室。

2 规范性引用文件。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 27025-2008 检测和校准实验室能力的通用要求 GA 765-2008 人血红蛋白检测 金标试剂条法 GA 766-2008 人精液PSA检测 金标试剂条法

3 术语与定义。下列术语和定义适用于本文件。

3.1前期检验 prior examination。DNA检验前进行的预试验和确证试验。

3.2DNA提取 DNA extraction。将DNA分子从其蛋白及其它细胞物质成份中分离提纯的过程和方法。

3.3遗传标记 genetic marker。由遗传决定,并能够以一定的规律从亲代传给子代的生物学特征。

3.4聚合酶链反应 polymerase chain reaction,PCR。一个酶促的特定DNA片段体外扩增过程。

4 前期检验。

4.1 血痕检验

4.1.1 预检验

4.1.1.1 联苯胺试验

4.1.1.1.1 试剂

联苯胺试剂配方如下:a) 联苯胺无水乙醇饱和液;b) 3%过氧化氢溶液;c) 冰醋酸。

配制方法见附录B。

4.1.1.1.2 方法。取滤纸轻轻擦拭斑迹,分别加冰醋酸、联苯胺无水乙醇饱和液、3%过氧化氢溶液,立即出现翠蓝色为阳性反应。

4.1.1.2 鲁米诺检验

4.1.1.2.1 试剂

鲁米诺试剂配方为:a) 鲁米诺粉末;b) 过氧化氢粉末。

4.1.1.2.2 方法

按1:5比例,分别将鲁米诺粉末0.1g与过氧化氢粉末0.5g置喷壶中,加入100 ml~200ml 蒸馏水混合,喷洒斑迹,立即出现蓝色荧光为阳性反应。

4.1.2 确证检验—金标试纸检验法

4.1.2.1 试剂确证检验主要试剂如下:a) 人血红蛋白检测金标试纸条;b) 纯水。

4.1.2.2 方法。见GA 765-2008。

4.2 精斑检验

4.2.1 确证检验—精子检出法

4.2.1.1 试剂。确证检验主要试剂如下:a) 1%酸性复红溶液;b) 1%美蓝溶液;c) 1%盐酸;d) 生理盐水。

4.2.1.2 方法。取少量可疑斑迹用适量生理盐水浸泡后,离心取沉渣涂于载玻片上,干燥后分别用1%酸性复红溶液和1%美蓝溶液染色,1%盐酸和清水洗涤,干燥后镜检。精子头部被染成红色,而尾部被染成蓝色。

4.2.2 确证检验—金标试纸检验法

4.2.2.1 试剂。确证检验主要试剂如下:a) 人前列腺特异性抗原检测金标试纸条;b) 纯水。

4.2.2.2 方法。见GA 766-2008。

5 DNA提取与纯化。详见附录A。

5.1 有机溶剂法。通过酚-氯仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质,保留DNA于水相溶液中的DNA提取方法。

5.2 聚苯乙烯二乙烯基苯树脂法。通过Chelex螯合镁、钠和钾等离子,使降解DNA的核酸酶失去活性的DNA提取方法。

5.3 硅珠法。在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下,通过二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中DNA分子的DNA提取方法。

5.4 磁珠法。在胍盐存在条件下,通过在硅胶外表涂上一层磁性树脂的磁珠,特异性的吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA的DNA提取与纯化方法。

5.5 十六烷基三甲基溴化胺法。通过非离子型去污剂CTAB破坏细胞壁和细胞膜及硬组织,并与DNA形成复合物,分离 DNA与蛋白质及多糖类物质的DNA提取方法。

5.6 硅胶膜吸附法。通过硅胶膜吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA,并经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质以及多糖等杂质的DNA提取与纯化方法。

5.7 FTA卡法。通过FTA卡裂解细胞释放DNA,从血液、口腔上皮细胞中获得DNA的方法。

5.8 全自动工作站法。采用全自动工作站结合上述提取、纯化方法进行DNA提取和纯化的方法。

5.9 乙醇沉淀纯化法

通过乙醇沉淀去盐,纯化DNA的方法。

5.10 异丙醇沉淀纯化法

通过异丙醇去多糖、蛋白,纯化DNA的方法。

5.11 其他商品化核酸提取和纯化试剂盒

参照试剂盒说明书操作。

5.12 自行开发的核酸提取和纯化方法

需按照GB/T 27025-2008要求进行方法确认。

6 DNA定量

6.1 紫外分光光度计法

6.1.1 预置分光光度计零点。

6.1.2 充分混匀样品,读取260nm和280nm的OD值。

6.1.3 计算A260/A280比率,比率大于1.6表明DNA较纯。

6.1.4 计算DNA浓度:

单链DNA: 1OD = 40 g/ml; 双链DNA: 1OD = 50 g/ml; DNA浓度(g/l) = 稀释倍数  A260  40 g/ml ÷ 1000l。

6.2 定量PCR仪定量

试剂和方法以说明书为准。

6.3 其他定量方法

试剂和方法以说明书为准。

7 人类DNA性别及STR(short tandem repeats)多态性分析

7.1 器材及试剂

检验所用主要器材及试剂如下:a) 全自动荧光分析仪及配套试剂;b) 扩增仪;c) 移液器;d) 人类荧光标记STR复合扩增试剂盒(包括带有ABO分型及直接扩增)。

试剂配制方法见附录B。

7.2 方法

7.2.1 人类荧光标记STR复合扩增试剂

7.2.1.1 选用获得认证的商品化试剂盒或获得认证的直接扩增试剂盒。

7.2.1.2 自行开发的试剂需按照GB/T 27025-2008要求经方法确认后方可使用于日常检案。

7.2.2 PCR扩增

7.2.2.1 扩增反应体系及循环参数,以各试剂盒的说明书为准;

7.2.2.2 设置阳性对照和阴性对照。

7.2.3 PCR反应产物的荧光检测。使用全自动荧光分析仪进行检测。器材、试剂、检测方法和数据分析以各试剂盒的说明书为准。

8 人类线粒体DNA测序。人类线粒体DNA(mtDNA)的非编码区D环(D-loop)含有两个变异率较高的高变区(High Variable Regions, HVR)I和II,本标准针对该两个区域HVR I和HVR II的测序,其他的DNA测序可参照本标准执行。

8.1 器材及试剂。检验所用主要器材及试剂如下:a) 全自动荧光分析仪及配套试剂;b) 扩增仪;c) 移液器;d) PCR试剂:引物(D-Loop高变区I或高变区II)L1、H1、L2、H2(L2、H2的碱基序列范围比L1、H1小,并包含在L1、H1的范围内),dNTP,Taq酶,PCR缓冲液;e) PCR产物纯化试剂盒;f) 测序试剂盒。

试剂配制方法见附录B。

8.2 方法

8.2.1 样本DNA的扩增— Nested-PCR法

8.2.1.1 第一步扩增:25l体系,取适量模板DNA,加入dNTP、引物L1和H1、PCR缓冲液、Taq酶,离心,PCR反应(反应参数根据具体引物的长度设定)。

8.2.1.2 第二步扩增:50l体系,取少量第一步扩增产物,加入dNTP、引物L2和H2、PCR缓冲液、Taq酶,离心,PCR反应(反应参数根据具体引物的长度设定)。

8.2.1.3 骨骼、毛干的测序从第一步开始,血液等富含DNA检材的测序从第二步开始。

8.2.2 扩增产物的纯化。材料和方法以纯化试剂盒的说明书为准。

8.2.3 测序反应。材料和方法以测序试剂盒的说明书为准。

8.2.4 荧光测序。使用全自动荧光分析仪进行测序,器材、试剂和方法以各说明书为准。

8.2.5 结果分析。运用分析软件进行自动分析,以Anderson(1981)报道的线粒体DNA序列为标准序列,测得样本的碱基序列与其比对,得到该样本线粒体DNA高变区段碱基序列的特征,结合电泳图谱复核结果。

8.3 遗传学分析。线粒体DNA D-loop 区碱基序列为单倍型,进行遗传学数量分析时应依照单倍型基因频率统计进行计算。 计算公式: P=ΣX2, h=(1-ΣX2)n/(n-1) 式中: X — 线粒体DNA单倍型在群体中的频率; P — 群体中任意两个体线粒体DNA 多态区序列相同的可能性; n — 检测的样品数量; h — 单倍型多样性。

8.4 其他商品化检测试剂盒。参照试剂盒说明书操作。

A

A 附 录 A (规范性附录) DNA的提取和纯化方法

A.1 有机溶剂法

A.1.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下:a) 高速离心机;b) 水浴或干浴;c) 移液器;d) 细胞溶解缓冲液;e) 蛋白溶解缓冲液;f) DNA提取缓冲液;g) TNE 缓冲液;h) TE缓冲液;i) 5×精子提取液;j) 纯化试剂盒(试剂和方法详见说明书);k) CentriconTM-100;l) SDS;m) DDT;n) 饱和酚和氯仿;o) 无水乙醇和70%乙醇溶液;p) NaCl或NaAc;q) 蛋白酶K。

A.1.2 方法

A.1.2.1 血液

A.1.2.1.1 取适量血液加入等体积细胞溶解缓冲液,混匀至透明。

A.1.2.1.2 离心后去上清液,沉淀中加入蛋白溶解缓冲液匀浆。

A.1.2.1.3 加入SDS和蛋白酶K,37℃消化4h以上。

A.1.2.1.4 加入等体积的酚、酚和氯仿(1:1混合)、氯仿各提取一次后,加1/10体积的NaCl或NaAc溶液和2.5倍体积的冷无水乙醇混匀,得到团状的DNA沉淀。

A.1.2.1.5 离心去上清液,沉淀中加入70%乙醇混匀。

A.1.2.1.6 离心去上清液,晾干后加入TE缓冲液或纯水备用。

A.1.2.2 混合斑

A.1.2.2.1 剪碎带有精子的检材,加入适量TNE 缓冲液, 37℃保温0.5h~1h,加入SDS和蛋白酶K, 37℃保温2h左右消化女性上皮细胞。

A.1.2.2.2 底部带孔离心管离心分离去除载体,并去除上清液,沉淀物用TNE洗涤离心数次。

A.1.2.2.3 沉淀物内加入5×精子提取液、蛋白酶K,置37℃消化3h~4h。

A.1.2.2.4 以下同A.1.2.1.4、A.1.2.1.5、A.1.2.1.6。

A.1.2.3 组织

A.1.2.3.1 取少量组织(脑、肌肉等)加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆。

A.1.2.3.2 加入SDS和蛋白酶K, 37℃消化4h~6h。

A.1.2.3.3 以下同A.1.2.1.4、A.1.2.1.5、A.1.2.1.6。

A.1.2.4 毛干

A.1.2.4.1 将毛干剪成3mm~5mm长,无水乙醇、纯水、无水乙醇各冲洗一次,晾干后加入DTT、SDS、蛋白酶K、蛋白溶解缓冲液, 37℃消化至完全溶解。

A.1.2.4.2 加入等体积的酚、酚∶氯仿(1∶1混合)、氯仿各抽提一次,加入 1/10体积的NaCl或NaAc溶液和2.5倍无水乙醇,混合后-20℃冷冻 1h以上。

A.1.2.4.3 离心去上清液,沉淀中加入70%乙醇混匀。

A.1.2.4.4 离心去上清液,晾干后加入TE缓冲液或纯水备用。

A.1.2.5 骨和牙齿

A.1.2.5.1 以手术刀刮净骨骼和牙齿表面垢物,用温热纯水冲洗两次,紫外光照射1h。再用锤子将牙齿砸成粉末和用电钻取骨密质和骨松质,并将其用研磨器进一步磨碎。

A.1.2.5.2 取适量骨或牙齿粉末,加入DNA提取缓冲液、蛋白酶K,于37℃消化过夜。

A.1.2.5.3 酚和氯仿提取,提取液置CentriconTM -100中离心浓缩后,加1/10体积的NaCl和2.5倍无水乙醇-20℃冰箱过夜。

A.1.2.5.4 离心去上清液,晾干加入TE缓冲液或纯水溶解,用纯化试剂盒纯化后备用。

A.2 Chelex法

A.2.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下:a) 高速离心机;b) 水浴或干浴;c) 移液器;d) Chelex-100;e) TNE 缓冲液;f) 蛋白酶K;g) SDS;h) DTT;i) 纯水。

A.2.2 方法

A.2.2.1 血液和血痕

A.2.2.1.1 取少量血液或血痕加入适量纯水,室温30min以上。

A.2.2.1.2 离心后去上清液,沉淀中加入Chelex-100,56℃消化 30min以上(干浴传热效果较水浴差,故采用干浴时,时间适当延长)。

A.2.2.1.3 煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.2 混合斑

A.2.2.2.1 剪碎带有精子的检材,加入适量TNE 缓冲液, 37℃保温0.5h~1h,加入SDS和蛋白酶K, 37℃保温2h左右消化女性上皮细胞。

A.2.2.2.2 底部带孔离心管离心分离去除载体,并去除上清液,沉淀物用TNE离心洗涤数次。

A.2.2.2.3 沉淀物内加入Chelex-100溶液、蛋白酶K和DTT溶液,置56℃消化2h左右。

A.2.2.2.4 煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.3 组织

A.2.2.3.1 取少量组织(脑、肌肉等)加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆。

A.2.2.3.2 加入Chelex-100 、蛋白酶K,56℃消化 2h~3h。

A.2.2.3.3 煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.4 唾液斑

A.2.2.4.1 信封和邮票用灭菌的双蒸水润湿的棉签涂抹信封封口处和邮票背面,烟蒂直接剪取外层纸,剪碎后加入Chelex-100、蛋白酶K,56℃消化1.5h以上。

A.2.2.4.2 煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.5 毛发

A.2.2.5.1 毛根剪取毛发的毛根部分5mm~10mm,毛干则剪成3mm~5mm长,无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次,晾干后加入 Chelex-100、蛋白酶K、DTT, 56℃消化至完全溶解。

A.2.2.5.2 煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.6 骨和牙齿

A.2.2.6.1 研碎的牙髓或骨髓,加入Chelex-100、蛋白酶K溶液,56℃消化过夜。

A.2.2.6.2 煮沸8min以上,离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.3 硅珠法

A.3.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下:a) 高速离心机;b) 水浴或干浴;c) 移液器;d) 吸附液;e) 漂洗液;f) 硅珠悬液;g) TES缓冲液;h) 十二烷基肌氨酸钠;i) SDS;j) DTT;k) 蛋白酶K;l) 无水乙醇和70%乙醇;m) 双蒸馏水。

A.3.2 方法

A.3.2.1 血液和血痕

A.3.2.1.1 取少量血液和血痕,加入TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠,煮沸5min以上,血痕离心去载体。

A.3.2.1.2 加入吸附液,混和后加入硅珠悬液,混和后室温15min左右。

A.3.2.1.3 离心去上清液,加入漂洗液,混合。

A.3.2.1.4 离心去上清液,加入冷70%乙醇,混合。

A.3.2.1.5 离心去上清液,加入TES,56℃保温10min以上。

A.3.2.1.6 离心后置4℃冰箱内保存备用。

A.3.2.2 混合斑

A.3.2.2.1 剪碎带有精子的检材,加入适量TES缓冲液、SDS和蛋白酶K溶液,37℃消化2h左右。

A.3.2.2.2 去载体,离心去上清液,TES缓冲液洗涤沉淀物数次。

A.3.2.2.3 加入TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠,煮沸5min以上。

A.3.2.2.4 离心后上清液按A.3.2.1.2~A.3.2.1.6操作进行。

A.3.2.3 毛发和指(趾)甲

A.3.2.3.1 毛发或指(趾)甲分别用双蒸馏水和无水乙醇洗涤,剪碎后加入TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和DTT溶液,56℃消化至完全溶解。

A.3.2.3.2 离心后上清液按A.3.2.1.2~A.3.2.1.6操作进行。

A.3.2.4 骨和牙齿

A.3.2.4.1 取适量骨或牙齿粉末(见有机溶剂提取法)分别用TES缓冲液和EDTA洗涤,加入TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和蛋白酶K、DTT溶液,56℃消化过夜。

A.3.2.4.2 离心后上清液按A.3.2.1.2~A.3.2.1.6操作进行。

A.4 磁珠法

A.4.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下:a) 磁架;b) 旋涡振荡器;c) 干浴或水浴;d) 移液器;e) 磁珠试剂盒(试剂和方法详见说明书);f) 纯水。

A.4.2 方法

A.4.2.1 取适量检材,加入适量裂解液95ºC~100ºC 30min以上。

A.4.2.2 去除载体,加入磁珠液,混合,室温5min左右。

A.4.2.3 旋涡振荡后置磁架上,去液体。

A.4.2.4 裂解液洗涤后置磁架上,去液体,重复3次左右。

A.4.2.5 室温下空气干燥5min~10min,加适量纯水,65ºC 5min左右。

A.4.2.6 混合后置磁架,将DNA溶液吸出备用。

A.5 CTAB法

A.5.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下:a) 高速离心机;b) 水浴或干浴;c) 移液器;d) CTAB提取缓冲液;e) 氯仿/异戊醇 (24:1);f) MicroconTM-100;g) 纯化试剂盒(试剂和方法详见说明书);h) 纯水。

A.5.2 方法

A.5.2.1 取适量骨或牙齿粉末(见有机溶剂提取法),加入CTAB提取缓冲液,室温过夜。

A.5.2.2 65℃保温1h以上,离心后保留上清液,加入等体积的氯仿/异戊醇 ,离心后保留上清液。

A.5.2.3 上清液加入MicroconTM -100中,离心浓缩。

A.5.2.4 浓缩液进行纯化,纯化试剂和方法以说明书为准。

A.6 硅胶膜吸附法

A.6.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下:a) 高速离心机;b) 水浴或干浴;c) 移液器;d) 硅胶模试剂盒(试剂和方法详见说明书);e) 无水乙醇;f) 纯水。

A.6.2 方法

A.6.2.1 取适量检材,加入适量裂解液85ºC 10min以上。

A.6.2.2 加蛋白酶K,混合,56ºC保温1h以上。

A.6.2.3 过硅胶模柱纯化。

A.6.2.4 加纯水洗脱,洗脱液备用。

A.7 FTA卡法

A.7.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下:a) 高速离心机;b) 移液器;c) 纯水。

A.7.2 方法

A.7.2.1 从FTA卡样品区剪取适量血斑,加入纯水,浸泡5min左右,去浸泡液,重复二次。

A.7.2.2 干燥待用。

A.8 全自动工作站法。器材、试剂和方法以说明书为准。

A.9 乙醇沉淀纯化法

A.9.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下:a) 高速离心机;b) 移液器;c) 10mol/L醋酸胺溶液;d) 无水乙醇和70%乙醇;e) 纯水。

A.9.2 方法

A.9.2.1 在DNA溶液中加入0.2倍体积10mol/L醋酸胺溶液和2倍体积冷的无水乙醇。

A.9.2.2 离心,去上清液。

A.9.2.3 70%乙醇洗涤沉淀2次,离心收集沉淀。

A.9.2.4 加入适量纯水或TE溶液,置4℃冰箱内低温保存备用。

A.10 异丙醇沉淀纯化法

A.10.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下:a) 高速离心机;b) 移液器;c) 66.7%异丙醇和75%异丙醇;d) 纯水。

A.10.2 方法

A.10.2.1 在DNA溶液中加入9倍体积66.7%异丙醇。

A.10.2.2 离心,去上清液。

A.10.2.3 加入75%异丙醇,混合,离心,去上清液。

A.10.2.4 干燥后,加入适量纯水,置4℃冰箱内低温保存备用。

B

B 附 录 B (规范性附录) 常用试剂推荐配方

B.1 联苯胺试剂

B.1.1 联苯胺无水乙醇饱和液(50ml)加冰醋酸5~6滴。

B.1.2 3%过氧化氢(30%过氧化氢1ml加纯水9ml)。

B.2 细胞溶解缓冲液(CLB)。0.64mol/L蔗糖,0.01mol/L MgCl2,0.02mol/L Tris-HCl pH7.6,2% TritonX-100。

B.3 蛋白溶解缓冲液(PLB)。75mmol/L NaCl,24mmol/L EDTA-Na2 pH8.0。

B.4 DNA提取缓冲液。10mmol/L Tris-HCl,pH8.0,10mmol/L EDTA,100mmol/L NaCl,2% SDS,39mmol/L DTT。

B.5 TNE 缓冲液。10mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L EDTA pH 8.0,100mol/L NaCl。

B.6 TE缓冲液。10mmol/L Tris-HCl,PH7.5, 1mmol/L EDTA。

B.7 5×精子提取液。50mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L EDTA pH 8.0,500 mmol/L NaCl,10% SDS溶液,0.5 mol/L DTT。

B.8 硅珠法吸附液。12g硫氰酸胍、10ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH6.4)、0.8ml 0.5mol/L EDTA、0.5ml Triton X-100。

B.9 硅珠法漂洗液。12g硫氰酸胍、10ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH6.4)。

B.10 硅珠悬液。0.06g二氧化硅、1ml纯水。

B.11 TES缓冲液。1ml 1mol/L Tris(pH8.0)、2ml 5mol/L NaCl、2ml 0.5mol/L(pH8.0) EDTA、95ml纯水。

B.12 CTAB提取缓冲液。20g CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)、1mol/L Tris-HCl(pH8.0) 100ml、0.5mol/L EDTA(pH8.0) 40ml、NaCl 81.82g,定容至1L,使用前加入4ml 2-巯基乙醇。




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