法庭科学DNA实验室检验规范（GAT 383-2014）

发布时间：2024-02-15 14:52:05 热度：236

法庭科学DNA实验室检验规范（GAT 383-2014）

1 范围。本标准规定了法庭科学DNA实验室检验应遵守的基本要求。 本标准适用于所有从事法庭科学检验的DNA实验室。

2 规范性引用文件。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 27025-2008 检测和校准实验室能力的通用要求 GA 765-2008 人血红蛋白检测 金标试剂条法 GA 766-2008 人精液PSA检测 金标试剂条法

3 术语与定义。下列术语和定义适用于本文件。

3.1前期检验 prior examination。DNA检验前进行的预试验和确证试验。

3.2DNA提取 DNA extraction。将DNA分子从其蛋白及其它细胞物质成份中分离提纯的过程和方法。

3.3遗传标记 genetic marker。由遗传决定,并能够以一定的规律从亲代传给子代的生物学特征。

3.4聚合酶链反应 polymerase chain reaction，PCR。一个酶促的特定DNA片段体外扩增过程。

4 前期检验。

4.1 血痕检验

4.1.1 预检验

4.1.1.1 联苯胺试验

4.1.1.1.1 试剂

联苯胺试剂配方如下：a) 联苯胺无水乙醇饱和液；b) 3%过氧化氢溶液；c) 冰醋酸。

配制方法见附录B。

4.1.1.1.2 方法。取滤纸轻轻擦拭斑迹，分别加冰醋酸、联苯胺无水乙醇饱和液、3%过氧化氢溶液，立即出现翠蓝色为阳性反应。

4.1.1.2 鲁米诺检验

4.1.1.2.1 试剂

鲁米诺试剂配方为：a) 鲁米诺粉末；b) 过氧化氢粉末。

4.1.1.2.2 方法

按1:5比例，分别将鲁米诺粉末0.1g与过氧化氢粉末0.5g置喷壶中，加入100 ml～200ml 蒸馏水混合，喷洒斑迹，立即出现蓝色荧光为阳性反应。

4.1.2 确证检验—金标试纸检验法

4.1.2.1 试剂确证检验主要试剂如下：a) 人血红蛋白检测金标试纸条；b) 纯水。

4.1.2.2 方法。见GA 765-2008。

4.2 精斑检验

4.2.1 确证检验—精子检出法

4.2.1.1 试剂。确证检验主要试剂如下：a) 1%酸性复红溶液；b) 1%美蓝溶液；c) 1%盐酸；d) 生理盐水。

4.2.1.2 方法。取少量可疑斑迹用适量生理盐水浸泡后，离心取沉渣涂于载玻片上，干燥后分别用1%酸性复红溶液和1%美蓝溶液染色，1%盐酸和清水洗涤，干燥后镜检。精子头部被染成红色，而尾部被染成蓝色。

4.2.2 确证检验—金标试纸检验法

4.2.2.1 试剂。确证检验主要试剂如下：a) 人前列腺特异性抗原检测金标试纸条；b) 纯水。

4.2.2.2 方法。见GA 766-2008。

5 DNA提取与纯化。详见附录A。

5.1 有机溶剂法。通过酚－氯仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质，保留DNA于水相溶液中的DNA提取方法。

5.2 聚苯乙烯二乙烯基苯树脂法。通过Chelex螯合镁、钠和钾等离子，使降解DNA的核酸酶失去活性的DNA提取方法。

5.3 硅珠法。在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下，通过二氧化硅微粒特异捕获有机质溶液中DNA分子的DNA提取方法。

5.4 磁珠法。在胍盐存在条件下，通过在硅胶外表涂上一层磁性树脂的磁珠，特异性的吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA的DNA提取与纯化方法。

5.5 十六烷基三甲基溴化胺法。通过非离子型去污剂CTAB破坏细胞壁和细胞膜及硬组织，并与DNA形成复合物，分离 DNA与蛋白质及多糖类物质的DNA提取方法。

5.6 硅胶膜吸附法。通过硅胶膜吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA，并经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质以及多糖等杂质的DNA提取与纯化方法。

5.7 FTA卡法。通过FTA卡裂解细胞释放DNA，从血液、口腔上皮细胞中获得DNA的方法。

5.8 全自动工作站法。采用全自动工作站结合上述提取、纯化方法进行DNA提取和纯化的方法。

5.9 乙醇沉淀纯化法

通过乙醇沉淀去盐，纯化DNA的方法。

5.10 异丙醇沉淀纯化法

通过异丙醇去多糖、蛋白，纯化DNA的方法。

5.11 其他商品化核酸提取和纯化试剂盒

参照试剂盒说明书操作。

5.12 自行开发的核酸提取和纯化方法

需按照GB/T 27025-2008要求进行方法确认。

6 DNA定量

6.1 紫外分光光度计法

6.1.1 预置分光光度计零点。

6.1.2 充分混匀样品，读取260nm和280nm的OD值。

6.1.3 计算A260/A280比率，比率大于1.6表明DNA较纯。

6.1.4 计算DNA浓度：

单链DNA: 1OD = 40 g/ml； 双链DNA: 1OD = 50 g/ml； DNA浓度(g/l) = 稀释倍数  A260  40 g/ml ÷ 1000l。

6.2 定量PCR仪定量

试剂和方法以说明书为准。

6.3 其他定量方法

试剂和方法以说明书为准。

7 人类DNA性别及STR（short tandem repeats）多态性分析

7.1 器材及试剂

检验所用主要器材及试剂如下：a) 全自动荧光分析仪及配套试剂；b) 扩增仪；c) 移液器；d) 人类荧光标记STR复合扩增试剂盒(包括带有ABO分型及直接扩增)。

试剂配制方法见附录B。

7.2 方法

7.2.1 人类荧光标记STR复合扩增试剂

7.2.1.1 选用获得认证的商品化试剂盒或获得认证的直接扩增试剂盒。

7.2.1.2 自行开发的试剂需按照GB/T 27025-2008要求经方法确认后方可使用于日常检案。

7.2.2 PCR扩增

7.2.2.1 扩增反应体系及循环参数，以各试剂盒的说明书为准；

7.2.2.2 设置阳性对照和阴性对照。

7.2.3 PCR反应产物的荧光检测。使用全自动荧光分析仪进行检测。器材、试剂、检测方法和数据分析以各试剂盒的说明书为准。

8 人类线粒体DNA测序。人类线粒体DNA（mtDNA）的非编码区D环（D-loop）含有两个变异率较高的高变区（High Variable Regions, HVR）I和II,本标准针对该两个区域HVR I和HVR II的测序，其他的DNA测序可参照本标准执行。

8.1 器材及试剂。检验所用主要器材及试剂如下：a) 全自动荧光分析仪及配套试剂；b) 扩增仪；c) 移液器；d) PCR试剂：引物(D-Loop高变区I或高变区II)L1、H1、L2、H2（L2、H2的碱基序列范围比L1、H1小，并包含在L1、H1的范围内），dNTP，Taq酶，PCR缓冲液；e) PCR产物纯化试剂盒；f) 测序试剂盒。

试剂配制方法见附录B。

8.2 方法

8.2.1 样本DNA的扩增— Nested-PCR法

8.2.1.1 第一步扩增：25l体系，取适量模板DNA，加入dNTP、引物L1和H1、PCR缓冲液、Taq酶，离心，PCR反应（反应参数根据具体引物的长度设定）。

8.2.1.2 第二步扩增：50l体系，取少量第一步扩增产物，加入dNTP、引物L2和H2、PCR缓冲液、Taq酶，离心，PCR反应（反应参数根据具体引物的长度设定）。

8.2.1.3 骨骼、毛干的测序从第一步开始，血液等富含DNA检材的测序从第二步开始。

8.2.2 扩增产物的纯化。材料和方法以纯化试剂盒的说明书为准。

8.2.3 测序反应。材料和方法以测序试剂盒的说明书为准。

8.2.4 荧光测序。使用全自动荧光分析仪进行测序，器材、试剂和方法以各说明书为准。

8.2.5 结果分析。运用分析软件进行自动分析，以Anderson(1981)报道的线粒体DNA序列为标准序列，测得样本的碱基序列与其比对，得到该样本线粒体DNA高变区段碱基序列的特征，结合电泳图谱复核结果。

8.3 遗传学分析。线粒体DNA D-loop 区碱基序列为单倍型，进行遗传学数量分析时应依照单倍型基因频率统计进行计算。 计算公式： P=ΣX2， h=(1-ΣX2)n/(n-1) 式中： X — 线粒体DNA单倍型在群体中的频率； P — 群体中任意两个体线粒体DNA 多态区序列相同的可能性； n — 检测的样品数量； h — 单倍型多样性。

8.4 其他商品化检测试剂盒。参照试剂盒说明书操作。

A

A 附 录 A （规范性附录） DNA的提取和纯化方法

A.1 有机溶剂法

A.1.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下：a) 高速离心机；b) 水浴或干浴；c) 移液器；d) 细胞溶解缓冲液；e) 蛋白溶解缓冲液；f) DNA提取缓冲液；g) TNE 缓冲液；h) TE缓冲液；i) 5×精子提取液；j) 纯化试剂盒（试剂和方法详见说明书）；k) CentriconTM-100；l) SDS；m) DDT；n) 饱和酚和氯仿；o) 无水乙醇和70%乙醇溶液；p) NaCl或NaAc；q) 蛋白酶K。

A.1.2 方法

A.1.2.1 血液

A.1.2.1.1 取适量血液加入等体积细胞溶解缓冲液，混匀至透明。

A.1.2.1.2 离心后去上清液，沉淀中加入蛋白溶解缓冲液匀浆。

A.1.2.1.3 加入SDS和蛋白酶K，37℃消化4h以上。

A.1.2.1.4 加入等体积的酚、酚和氯仿(1:1混合)、氯仿各提取一次后，加1/10体积的NaCl或NaAc溶液和2.5倍体积的冷无水乙醇混匀，得到团状的DNA沉淀。

A.1.2.1.5 离心去上清液，沉淀中加入70%乙醇混匀。

A.1.2.1.6 离心去上清液，晾干后加入TE缓冲液或纯水备用。

A.1.2.2 混合斑

A.1.2.2.1 剪碎带有精子的检材，加入适量TNE 缓冲液， 37℃保温0.5h～1h，加入SDS和蛋白酶K， 37℃保温2h左右消化女性上皮细胞。

A.1.2.2.2 底部带孔离心管离心分离去除载体，并去除上清液，沉淀物用TNE洗涤离心数次。

A.1.2.2.3 沉淀物内加入5×精子提取液、蛋白酶K，置37℃消化3h～4h。

A.1.2.2.4 以下同A.1.2.1.4、A.1.2.1.5、A.1.2.1.6。

A.1.2.3 组织

A.1.2.3.1 取少量组织(脑、肌肉等)加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆。

A.1.2.3.2 加入SDS和蛋白酶K， 37℃消化4h～6h。

A.1.2.3.3 以下同A.1.2.1.4、A.1.2.1.5、A.1.2.1.6。

A.1.2.4 毛干

A.1.2.4.1 将毛干剪成3mm～5mm长，无水乙醇、纯水、无水乙醇各冲洗一次，晾干后加入DTT、SDS、蛋白酶K、蛋白溶解缓冲液， 37℃消化至完全溶解。

A.1.2.4.2 加入等体积的酚、酚∶氯仿（1∶1混合）、氯仿各抽提一次，加入 1/10体积的NaCl或NaAc溶液和2.5倍无水乙醇，混合后-20℃冷冻 1h以上。

A.1.2.4.3 离心去上清液，沉淀中加入70%乙醇混匀。

A.1.2.4.4 离心去上清液，晾干后加入TE缓冲液或纯水备用。

A.1.2.5 骨和牙齿

A.1.2.5.1 以手术刀刮净骨骼和牙齿表面垢物，用温热纯水冲洗两次，紫外光照射1h。再用锤子将牙齿砸成粉末和用电钻取骨密质和骨松质，并将其用研磨器进一步磨碎。

A.1.2.5.2 取适量骨或牙齿粉末，加入DNA提取缓冲液、蛋白酶K，于37℃消化过夜。

A.1.2.5.3 酚和氯仿提取，提取液置CentriconTM -100中离心浓缩后，加1/10体积的NaCl和2.5倍无水乙醇-20℃冰箱过夜。

A.1.2.5.4 离心去上清液，晾干加入TE缓冲液或纯水溶解，用纯化试剂盒纯化后备用。

A.2 Chelex法

A.2.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下：a) 高速离心机；b) 水浴或干浴；c) 移液器；d) Chelex-100；e) TNE 缓冲液；f) 蛋白酶K；g) SDS；h) DTT；i) 纯水。

A.2.2 方法

A.2.2.1 血液和血痕

A.2.2.1.1 取少量血液或血痕加入适量纯水，室温30min以上。

A.2.2.1.2 离心后去上清液，沉淀中加入Chelex-100，56℃消化 30min以上（干浴传热效果较水浴差，故采用干浴时，时间适当延长）。

A.2.2.1.3 煮沸8min以上，离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.2 混合斑

A.2.2.2.1 剪碎带有精子的检材，加入适量TNE 缓冲液， 37℃保温0.5h～1h，加入SDS和蛋白酶K， 37℃保温2h左右消化女性上皮细胞。

A.2.2.2.2 底部带孔离心管离心分离去除载体，并去除上清液，沉淀物用TNE离心洗涤数次。

A.2.2.2.3 沉淀物内加入Chelex-100溶液、蛋白酶K和DTT溶液，置56℃消化2h左右。

A.2.2.2.4 煮沸8min以上，离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.3 组织

A.2.2.3.1 取少量组织(脑、肌肉等)加入适量蛋白溶解缓冲液进行匀浆。

A.2.2.3.2 加入Chelex-100 、蛋白酶K，56℃消化 2h～3h。

A.2.2.3.3 煮沸8min以上，离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.4 唾液斑

A.2.2.4.1 信封和邮票用灭菌的双蒸水润湿的棉签涂抹信封封口处和邮票背面，烟蒂直接剪取外层纸，剪碎后加入Chelex-100、蛋白酶K，56℃消化1.5h以上。

A.2.2.4.2 煮沸8min以上，离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.5 毛发

A.2.2.5.1 毛根剪取毛发的毛根部分5mm～10mm，毛干则剪成3mm～5mm长，无水乙醇、水、无水乙醇各冲洗一次，晾干后加入 Chelex-100、蛋白酶K、DTT， 56℃消化至完全溶解。

A.2.2.5.2 煮沸8min以上，离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.2.2.6 骨和牙齿

A.2.2.6.1 研碎的牙髓或骨髓，加入Chelex-100、蛋白酶K溶液，56℃消化过夜。

A.2.2.6.2 煮沸8min以上，离心后置4℃冰箱内低温保存备用。

A.3 硅珠法

A.3.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下：a) 高速离心机；b) 水浴或干浴；c) 移液器；d) 吸附液；e) 漂洗液；f) 硅珠悬液；g) TES缓冲液；h) 十二烷基肌氨酸钠；i) SDS；j) DTT；k) 蛋白酶K；l) 无水乙醇和70%乙醇；m) 双蒸馏水。

A.3.2 方法

A.3.2.1 血液和血痕

A.3.2.1.1 取少量血液和血痕，加入TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠，煮沸5min以上，血痕离心去载体。

A.3.2.1.2 加入吸附液，混和后加入硅珠悬液，混和后室温15min左右。

A.3.2.1.3 离心去上清液，加入漂洗液，混合。

A.3.2.1.4 离心去上清液，加入冷70%乙醇，混合。

A.3.2.1.5 离心去上清液，加入TES，56℃保温10min以上。

A.3.2.1.6 离心后置4℃冰箱内保存备用。

A.3.2.2 混合斑

A.3.2.2.1 剪碎带有精子的检材，加入适量TES缓冲液、SDS和蛋白酶K溶液,37℃消化2h左右。

A.3.2.2.2 去载体，离心去上清液，TES缓冲液洗涤沉淀物数次。

A.3.2.2.3 加入TES缓冲液和十二烷基肌氨酸钠，煮沸5min以上。

A.3.2.2.4 离心后上清液按A.3.2.1.2～A.3.2.1.6操作进行。

A.3.2.3 毛发和指（趾）甲

A.3.2.3.1 毛发或指（趾）甲分别用双蒸馏水和无水乙醇洗涤，剪碎后加入TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和DTT溶液，56℃消化至完全溶解。

A.3.2.3.2 离心后上清液按A.3.2.1.2～A.3.2.1.6操作进行。

A.3.2.4 骨和牙齿

A.3.2.4.1 取适量骨或牙齿粉末（见有机溶剂提取法）分别用TES缓冲液和EDTA洗涤，加入TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠和蛋白酶K、DTT溶液，56℃消化过夜。

A.3.2.4.2 离心后上清液按A.3.2.1.2～A.3.2.1.6操作进行。

A.4 磁珠法

A.4.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下：a) 磁架；b) 旋涡振荡器；c) 干浴或水浴；d) 移液器；e) 磁珠试剂盒（试剂和方法详见说明书）；f) 纯水。

A.4.2 方法

A.4.2.1 取适量检材，加入适量裂解液95ºC～100ºC 30min以上。

A.4.2.2 去除载体，加入磁珠液，混合，室温5min左右。

A.4.2.3 旋涡振荡后置磁架上，去液体。

A.4.2.4 裂解液洗涤后置磁架上，去液体，重复3次左右。

A.4.2.5 室温下空气干燥5min～10min，加适量纯水，65ºC 5min左右。

A.4.2.6 混合后置磁架，将DNA溶液吸出备用。

A.5 CTAB法

A.5.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下：a) 高速离心机；b) 水浴或干浴；c) 移液器；d) CTAB提取缓冲液；e) 氯仿/异戊醇 (24：1)；f) MicroconTM-100；g) 纯化试剂盒（试剂和方法详见说明书）；h) 纯水。

A.5.2 方法

A.5.2.1 取适量骨或牙齿粉末（见有机溶剂提取法），加入CTAB提取缓冲液，室温过夜。

A.5.2.2 65℃保温1h以上，离心后保留上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇 ，离心后保留上清液。

A.5.2.3 上清液加入MicroconTM -100中，离心浓缩。

A.5.2.4 浓缩液进行纯化，纯化试剂和方法以说明书为准。

A.6 硅胶膜吸附法

A.6.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下：a) 高速离心机；b) 水浴或干浴；c) 移液器；d) 硅胶模试剂盒（试剂和方法详见说明书）；e) 无水乙醇；f) 纯水。

A.6.2 方法

A.6.2.1 取适量检材，加入适量裂解液85ºC 10min以上。

A.6.2.2 加蛋白酶K，混合，56ºC保温1h以上。

A.6.2.3 过硅胶模柱纯化。

A.6.2.4 加纯水洗脱，洗脱液备用。

A.7 FTA卡法

A.7.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下：a) 高速离心机；b) 移液器；c) 纯水。

A.7.2 方法

A.7.2.1 从FTA卡样品区剪取适量血斑，加入纯水，浸泡5min左右，去浸泡液，重复二次。

A.7.2.2 干燥待用。

A.8 全自动工作站法。器材、试剂和方法以说明书为准。

A.9 乙醇沉淀纯化法

A.9.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下：a) 高速离心机；b) 移液器；c) 10mol/L醋酸胺溶液；d) 无水乙醇和70%乙醇；e) 纯水。

A.9.2 方法

A.9.2.1 在DNA溶液中加入0.2倍体积10mol/L醋酸胺溶液和2倍体积冷的无水乙醇。

A.9.2.2 离心，去上清液。

A.9.2.3 70%乙醇洗涤沉淀2次，离心收集沉淀。

A.9.2.4 加入适量纯水或TE溶液，置4℃冰箱内低温保存备用。

A.10 异丙醇沉淀纯化法

A.10.1 器材和试剂。主要器材及试剂如下：a) 高速离心机；b) 移液器；c) 66.7%异丙醇和75%异丙醇；d) 纯水。

A.10.2 方法

A.10.2.1 在DNA溶液中加入9倍体积66.7%异丙醇。

A.10.2.2 离心，去上清液。

A.10.2.3 加入75%异丙醇，混合，离心，去上清液。

A.10.2.4 干燥后，加入适量纯水，置4℃冰箱内低温保存备用。

B

B 附 录 B （规范性附录） 常用试剂推荐配方

B.1 联苯胺试剂

B.1.1 联苯胺无水乙醇饱和液（50ml）加冰醋酸5～6滴。

B.1.2 3%过氧化氢（30%过氧化氢1ml加纯水9ml）。

B.2 细胞溶解缓冲液（CLB）。0.64mol/L蔗糖，0.01mol/L MgCl2，0.02mol/L Tris-HCl pH7.6，2% TritonX-100。

B.3 蛋白溶解缓冲液（PLB）。75mmol/L NaCl，24mmol/L EDTA-Na2 pH8.0。

B.4 DNA提取缓冲液。10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，10mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，2% SDS，39mmol/L DTT。

B.5 TNE 缓冲液。10mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L EDTA pH 8.0，100mol/L NaCl。

B.6 TE缓冲液。10mmol/L Tris-HCl,PH7.5, 1mmol/L EDTA。

B.7 5×精子提取液。50mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA pH 8.0，500 mmol/L NaCl，10% SDS溶液，0.5 mol/L DTT。

B.8 硅珠法吸附液。12g硫氰酸胍、10ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH6.4)、0.8ml 0.5mol/L EDTA、0.5ml Triton X-100。

B.9 硅珠法漂洗液。12g硫氰酸胍、10ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH6.4)。

B.10 硅珠悬液。0.06g二氧化硅、1ml纯水。

B.11 TES缓冲液。1ml 1mol/L Tris(pH8.0)、2ml 5mol/L NaCl、2ml 0.5mol/L(pH8.0) EDTA、95ml纯水。

B.12 CTAB提取缓冲液。20g CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）、1mol/L Tris-HCl(pH8.0) 100ml、0.5mol/L EDTA(pH8.0) 40ml、NaCl 81.82g,定容至1L，使用前加入4ml 2-巯基乙醇。