白片DNA鉴定，同一认定需要注意什么？

发布时间：2025-12-24 12:52:37 热度：2

白片（通常指未经染色的病理组织切片，如FFPE白片）用于DNA鉴定进行同一认定时，是一项技术要求高且严谨的工作。由于样本的特殊性（DNA可能降解、含量低、有交联损伤），需要格外注意以下关键环节，以确保结果的准确性和证据的合法性：

一、 样本获取与前期处理阶段

样本同一性确认：

链条完整性：确保白片从医院病理科、档案馆或送检方到鉴定实验室的流转过程有完整、无间断的证据链。所有交接环节必须记录在案，双方签字确认，防止样本混淆、调换或污染。

信息核对：仔细核对白片上的标识信息（如病理号、姓名、切片序号等）与送检委托书是否完全一致。任何信息不符都必须查明原因，否则不能受理。

样本质量评估与预处理：

切片选择：优先选择含目标组织（如肿瘤组织、正常组织）最丰富、坏死或杂质最少的切片。可能需要病理医师在显微镜下标记目标区域（刮取或宏切割）。

脱蜡与消化：必须彻底去除石蜡，否则会严重抑制后续的DNA提取和PCR反应。使用合适的脱蜡试剂（如二甲苯）和充分的消化步骤（蛋白酶K消化）来释放和修复受损的DNA。

DNA提取纯化：针对FFPE样本降解和交联的特点，选用经过验证的、适用于FFPE样本的DNA提取试剂盒，并可能需要进行额外的纯化步骤以去除PCR抑制剂。

二、 DNA检验与分析阶段

DNA质量与浓度评估：

不能仅用紫外分光光度计（如NanoDrop）测量浓度和纯度，因为它会高估降解DNA的浓度且无法反映片段大小。

必须使用荧光定量法（如Qubit） 精确测定双链DNA浓度。

强烈建议进行DNA完整性分析，例如使用琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪（如Agilent 2100）查看DNA片段大小分布，判断降解程度。

检测体系选择与验证：

优先选择短片段扩增体系：由于FFPE样本DNA通常严重降解成小片段（100-300bp），因此必须使用扩增片段更短的多重PCR试剂盒。例如，在STR分型中，应选用专门为降解DNA设计的“miniSTR”试剂盒或当前主流的新一代检测试剂盒（其扩增子长度通常在70-250bp之间）。

试剂盒验证：实验室在使用任何新试剂盒或方法处理FFPE样本前，必须进行方法学验证，确认其对该类样本的灵敏度、特异性和稳定性。

多态性标记选择：除了常染色体STR，根据实际情况可考虑增加Y-STR、X-STR或SNP检测。SNP位点扩增片段更短（可<100bp），对于高度降解的白片样本可能成功率更高。

实验过程防污染：

严格的物理隔离：白片样本的前处理、DNA提取、PCR加样、扩增后检测必须在独立的房间或超净工作台进行，遵循单向工作流。

阴性对照与阳性对照：每个批次实验必须包含：

提取阴性对照（在DNA提取时加入的无样本空白试剂），用于监控提取过程中的污染。

PCR阴性对照（用纯水代替DNA模板），用于监控PCR试剂和环境的污染。

阳性对照（已知基因型的标准品），用于确认整个检测系统工作正常。

人员与耗材：操作人员需穿戴专用防护装备，使用带滤芯的吸头，定期清洁工作环境。

三、 结果分析与解释阶段

数据判读的审慎性：

等位基因丢失：由于DNA损伤，可能导致某些STR位点一个或两个等位基因无法扩增（等位基因丢失），表现为假纯合子。分析图谱时需高度警惕。

非模板添加：降解和低模板量DNA更容易产生非特异性峰（如stutter峰增高、pull-up峰等），需由经验丰富的分析人员根据峰高、峰型平衡等参数谨慎判读。

阈值设置：合理设置分析阈值（AT）和随机阈值（ST），低于AT的峰一般不认定为有效等位基因。

同一认定标准与结论表述：

匹配标准：通常要求所有可比的STR基因座分型结果完全一致，才能做出“支持来自同一个体”的结论。即使仅有一个基因座不符（且排除实验误差和突变后），就必须做出“排除”结论。

统计学评估：对于匹配的结果，必须计算其随机匹配概率或似然率，以量化支持同一认定的强度。数值通常需要达到极高的标准（如RMP小于10^-9）。

报告不确定性：对于因样本降解导致部分基因座分型失败或数据质量不佳的情况，应在报告中明确说明，并谨慎评估结论的可靠性。不能获得完整分型时，同一认定的力度会下降。

结论表述：严格依据行业规范（如《法庭科学DNA数据库建设规范》、《亲权鉴定技术规范》等）中的标准措辞进行表述，如“支持……”、“排除……”、“不排除……”等，避免使用绝对化语言。

四、 质量体系与法律要求

实验室资质：进行司法同一认定的实验室必须通过CMA（检验检测机构资质认定）和/或CNAS（中国合格评定国家认可委员会）认可，其方法、人员和环境符合国家标准。

人员资质：实验操作、数据分析和报告签发人员需具备相应的专业背景、培训合格和授权。

全过程记录：从样本接收、处理、检测到数据分析的每一个步骤都应有清晰、可追溯的原始记录。

复核制度：关键样本或复杂图谱应由另一位有资质的鉴定人进行独立复核。

总结与核心建议

白片DNA同一认定的核心挑战在于 “从质量不佳的样本中获取可靠数据” 。因此，操作的核心思路是：

前期谨慎评估样本，选择合适方法；中期严格防污染，使用短片段体系；后期审慎判读数据，科学解释结果。

务必在整个流程中贯彻 “质量控制” 和 “证据链完整性” 两大原则，才能确保鉴定结论的准确、可靠、合法、有效。

如果涉及刑事案件或重大司法判决，建议委托具有权威资质和丰富FFPE样本处理经验的司法鉴定机构进行。